超越“大概可能”——ELISA数据可靠性提升指南

ELISA实验是测定蛋白质浓度相对准确的实验方法，尤其是测定大分子蛋白。ELISA法是最接近样本真实浓度的，该实验又对实验室要求相对较低，用到的仪器比较简单，方便操作，这也是ELISA方法经久不衰的主要原因。

【1】标准品稀释不当，建议：正确稀释标准品。

【2】标准品没有充分溶解，建议：注意混匀，使冻干粉充分溶解。

【3】反应时间过短，温度过低，建议：按照说明书上反应时间和孵育温度，可提前预热烘箱。

【1】了解样本背景，若样本中目的蛋白本身表达较低，含量低于检测范围。 解决方案：如果不是低很多的情况，可以增加加样量，如果样本OD值很低，可以反馈给SAB，看是否可以优化提高试剂盒灵敏度，或者更换更灵敏的ELISA试剂盒。

【2】样本保存不当导致样本降解或污染。解决方案：样本收集后避免反复冻融，避免样本存放过久。

【3】试剂盒已经过期，或样本稀释液被强酸强碱污染，或实验的PH不对。

【4】样本中目的蛋白浓度过高形成hook效应。

【1】洗涤不彻底。建议：增加洗涤次数，或者按照说明书推荐的洗涤方式充分洗涤。

【2】洗涤液被污染。建议：使用新鲜洗涤液。

【3】没有及时终止。建议：加入底物后要注意反应时间，中途观察颜色变化，及时终止。

【4】底物变质或污染。建议：实验前观察底物是否有污染或者变蓝，使用新鲜底物。

【5】没有及时读数。建议：提前预热酶标仪，加入终止液后及时读数。

【6】玻璃器皿中有污染物。建议：实验前确保所有仪器耗材洁净。

【7】底物曝光变蓝。建议：实验前注意观察底物确保无色，底物孵育时注意避光。

【8】孵育温度过高。建议：确保烘箱恒温，并保证都是37度孵育。

整个板子无显色。

① 建议：用1ul检测B加入50ul底物，看是否有颜色变化，如果没有颜色变化证明是检测B显色剂失效。

② 检查是否把洗涤液当稀释液，或者检测A和检测B弄混淆加错顺序等。

【1】洗板机某几个加液头堵塞导致花板、跳孔。

【2】手动拍板时交叉污染。

【3】加样时交叉污染。

【4】实验前没有把所有试剂平衡至室温

【5】稀释标准品后，冻干粉没有充分溶解。

【6】及时更换枪头，实验操作中戴手套和口罩，谨防飞沫等污染。

【1】样本因素

       标本采集和处理不规范，严重溶血或者脂血的样本，血清中混有红细胞或纤维蛋白原，这两种物质易沉淀或附着在酶标板孔内，不易洗涤干净。

       因此样本采集时候或者血清分离时要注意避免溶血、脂血、细菌污染。如果有溶血，浑浊或有絮状物时，应自然放置1-2小时，或者37度水浴放置10分钟使血液充分凝固收缩，适当加强离心速度，延长离心时间例如3000r/min 离心15分钟，使血细胞和纤维蛋白充分沉淀，血细胞和血清分离后取上清，尽量使标本中非特异性物质所致的假阳性率降到最低。

【2】操作因素

       加样：加标本时候交叉污染会导致假阳性，例如，盛放标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。

       加样太快：难以保证加样的准确性和均一性，如果加在孔壁上部的非包被区，也容易导致非特异性结合造成的假阳性。

【3】洗涤

       酶标板的原材料，具有较强的吸附蛋白质的性能，因此被广泛应用于ELISA包被， 但它既可以吸附特异性蛋白质，也可以吸附非特异性蛋白质，所以需要在洗涤时把这些非特异性物质洗涤下来，通过洗涤来清除这些非特异性吸附的干扰物。 因此洗涤有时决定着实验的成败。

【4】底物

       底物成分易不稳定，底物按要求保存，若保存不当，极有可能出现花板现象。

【5】边缘效应

       边缘效应指的是外周孔显色较中心孔更深，原因是96孔板、周边孔与中心孔表面热力学梯度不同，工作环境温度不均衡，建议：使用水浴，或者在把反应溶液加入板孔时，将板和溶液都加热到温浴温度（例如37度），就可以避免边缘效应，且可提高测定重复性。

【6】人为因素

       操作过程中不及时更换枪头；人为改变实验步骤；延长或缩短反应时间；随意增减洗涤次数或者洗涤量；配置洗涤工作液时候太随意，导致浓度过高或者过低。